在生物医学研究和基因功能探索中，条件性基因敲除技术占据了举足轻重的地位。其中，Cre-LoxP 系统以其独特的工作原理和广泛的应用场景，成为了研究基因功能不可或缺的利器。今天，我们就来深入了解这一强大的基因编辑工具——Cre-LoxP 系统。
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什么是 Cre-LoxP 系统？
Cre-LoxP 系统是一种基于位点特异性重组的基因编辑技术，由 Cre 重组酶和 LoxP 位点两部分组成。
图 1. Cre-loxP system[1]。
Cre 重组酶 (Cyclization Recombination Enzyme) 由噬菌体 P1 的环化重组酶基因产生的一个 38 kDa 的 DNA 重组酶，可以识别 loxP (locus of x-over, P1) 位点的特定 DNA 片段序列，并介导两个 loxP 位点之间 DNA 序列的位点特异性缺失。
loxP 位点是一个 34 bp 的序列，由两个 13 bp 的反转和回文重复序列和 8 bp 的核心序列组成。Cre-loxP 主要用于基因敲除，但它也会根据 loxP 位点的取向和位置诱导两个 loxP 位点之间的 DNA 反转和易位[1]。
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常用的 Cre-loxP 诱变系统
图 2. Cre-loxP 诱变系统的原理[1]。
▐ Cre-ER (Tam) 系统
Cre-ER (Tam) 系统，也称为他莫昔芬 (Tamoxifen)（详情：https://www.medchemexpress.cn/Tamoxifen.html） 诱导的 Cre 系统，是 Cre-LoxP 系统中最为常用的一种诱导型系统[1][2]。
图 3. Cre-ERT 基因敲除小鼠案例[3]。
A. Cre-ERT 小鼠模型的构建 B. 他莫昔芬诱导后，PDGFBNull-MG 小鼠皮质神经元表现出 Kcnd3表达的降低。
该系统通过将 Cre 重组酶与与含有突变配体结合域的雌激素受体 (ER-LBD) 融合，形成 CreER 融合蛋白。在没有 Tamoxifen 的情况下，CreER 融合蛋白与热休克蛋白 90 (HSP90) 相互作用并定位于细胞质中。给予他莫昔芬/ 4-羟基他莫昔芬后，会破坏 HSP90 与 CreER 的相互作用，使 CreER 进入细胞核，识别并切割 LoxP 位点间的 DNA 序列，从而实现条件性基因敲除[1]。
为了提高他莫昔芬或 4-OHT 诱导的效率，在 CreERT 后产生 CreERT2，它在体内对 4-OHT 的敏感性约为 CreERT 的 10 倍。因此，CreERT2 在一些生物学领域更受青睐[2]。
▐ Tet-on 与 Tet-off 系统
除了 Cre-ER (Tam) 系统外，Tet-on 和 Tet-off 系统也是常用的条件性基因表达系统。Tet 系统由逆四环素控制的激活剂 (rtTA)、四环素控制的激活剂 (tTA) 和四环素响应元件 (TRE，也被称为四环素操纵子 TetO，它调节 cre 基因的表达) 三部分组成。
图 4. DOX 诱导的 Cre 系统[4]。
A. 构建模型，DOX 激活了在 SP-C 启动子控制下表达的 rtTA。B-D. 妊娠期间用强力霉素来诱导的 Cre 介导的 floxed AP 或 GFP 基因的激活。
Tet-on 系统通过四环素(Tetracycline)（详情：https://www.medchemexpress.cn/Tetracycline.html） 或其衍生物多西环素(Doxycycline)(详情：https://www.medchemexpress.cn/doxycycline.html） 的添加来激活基因表达。在三重转基因动物中，rtTA 在 SP-C 启动子的控制下在上皮细胞中表达。Doxycycline (DOX)与 rtTA 结合，激活Cre的表达，导致固定的报告基因重组(图4A)。而 Tet-off 系统则相反，在去除四环素时激活基因表达[1]。
03
Cre-loxP 基因敲除小鼠的构建方法
1. 构建 Flox 小鼠：首先，将 LoxP 序列插入到需要删除 DNA 区域的两端，这一区域通常被称为 flox 区。获得的小鼠称为 Flox 小鼠，其基因功能在正常情况下保持不变。
2. 选择 Cre 工具鼠：根据实验需求，选择具有组织或细胞特异性启动子的 Cre 工具鼠。这些小鼠能够在特定的组织或细胞中表达 Cre 重组酶。
3. 杂交与筛选：将 Flox 小鼠与 Cre 工具鼠进行杂交，通过多代交配筛选出同时携带 Flox 基因和 Cre 基因的小鼠。这些小鼠在特定组织或细胞中，当 Cre 重组酶表达时，会实现条件性基因敲除[1]。
图 5. Cre-loxP 基因敲除小鼠一般育种原则[1]。
▐ 诱导方法
药物方法
Tamoxifen（详情：https://www.medchemexpress.cn/Tamoxifen.html)Adult PdgfbNull-MG mice; 75 mg/kg Tamoxifen (dissolved in corn oil) intraperitoneal injection (i.p.) for 5 consecutive days[3].
Hif1af/f; Foxl2-CreERT2 female mice (3 weeks); 100 mg/kg Tamoxifen (freshly dissolved in sunflower oil) intraperitoneal injection (i.p.) for 5 consecutive days[5].
Doxycycline(详情 :https://www.medchemexpress.cn/doxycycline.html)C57BL/6 tetO-Cre mice (TRE-Cre); 600 mg/kg Doxycycline-containing diet for 14 days[6].
知识链接
Tamoxifen、四环素、多西环素均不溶于水，使用时注意使用助溶剂或超声助溶。
Tamoxifen 是 Cre-loxP 模型中最常用的化学诱导剂，不溶于水，一般溶于乙醇、玉米油或葵花籽油中使用，-20℃ 避光保存，使用前可 37℃ 下解冻并超声 5 分钟。
成年小鼠给药Tamoxifen 剂量范围为 75 mg/kg~100 mg/kg，给药方式可以选择口服、灌胃或者腹腔注射，目前最常用的是连续5天腹腔注射的方式。
给药剂量和频率需根据实验动物的种类、年龄、体重以及实验目的等因素确定，并遵循实验动物伦理和实验规范[7][8][9]。
注意事项[8]
处理过的动物和未处理过的动物应分开饲养，关在同一个笼子里，可能会发生他莫昔芬交叉污染。舔舐油性他莫昔芬悬浮液，梳理或食粪行为可以引起基因敲除。
诱导后，需要等待一段时间 (如数小时至数天) 以允许 Cre 重组酶进入细胞核并发挥作用。
可以通过分子生物学和遗传学方法验证是否敲除成功。如：Western blot、PCR、测序、组织学检查。
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小结
大家在实际实验过程中要进行根据实验目的和基因表达特性选择合适的诱导时间，过早或过晚的诱导都可能影响实验结果。在使用这些药物时，需要综合考虑实验需求、药物特性以及实验动物的生理状态等因素，以确保实验的成功和结果的可靠。
参考文献：
[1] Kim H, et al. Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles of target genes. Lab Anim Res. 2018 Dec;34(4):147-159.
[2] Indra AK, et al. Temporally-controlled site-specific mutagenesis in the basal layer of the epidermis: comparison of the recombinase activity of the tamoxifen-inducible Cre-ER(T) and Cre-ER(T2) recombinases. Nucleic Acids Res. 1999;27(22):4324-4327.
[3] Bi Q, et al. Microglia-derived PDGFB promotes neuronal potassium currents to suppress basal sympathetic tonicity and limit hypertension. Immunity. 2022 Aug 9;55(8):1466-1482.e9.
[4] Perl AK, et al. Early restriction of peripheral and proximal cell lineages during formation of the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002;99(16):10482-10487.
[5] H, Wang J. FSHR-mTOR-HIF1 signaling alleviates mouse follicles from AMPK-induced atresia. Cell Rep. 2023 Oct 31;42(10):113158.
[6] Lewis KT, et al. Tetracycline response element driven Cre causes ectopic recombinase activity independent of transactivator element. Mol metab. 2022 Jul;61:101501.
[7] Donocoff RS, et al. Optimization of tamoxifen-induced Cre activity and its effect on immune cell populations. Sci Rep. 2020;10(1):15244.
[8] Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods Mol Biol. 2009;530:343-63.
[9] Jahn HM, et al. Refined protocols of tamoxifen injection for inducible DNA recombination in mouse astroglia. Sci Rep. 2018 Apr 12;8(1):5913.